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VE Elisa Kit斑點免疫金銀染色法實驗原理

VE Elisa Kit試劑及材料

1. NC膜

2. 20mol/L，pH7.6 PBS

3. BSA

4. 定影液：20%。

5. 電泳儀和電轉(zhuǎn)儀

6. 其它試劑同上

操作方法

1. 用微量加樣器在NC膜上直接點樣1-2ml(若抗原含量少，可重復(fù)點樣)，或經(jīng)轉(zhuǎn)移電泳將抗原吸附在NC膜上，自然干燥;

2. 將點樣后的NC膜浸入含5%BSA和0.05% NaN3的20mol/L，pH7.6 PBS內(nèi)，37℃，30min，以封閉未飽和的蛋白質(zhì)結(jié)合位點;

3. 用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min;滴加適當(dāng)稀釋的一抗(1-2mg/ml，VE Elisa Kit用含0.1%BSA和正常羊或兔血清的TBS稀釋)，陰性對照用稀釋液代替抗體，在室溫下，反應(yīng)2h;

4. 用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min后，將NC膜浸入金標(biāo)二抗溶液中(金標(biāo)抗體用含0.4%明膠和0.1%BSA的TBS適當(dāng)稀釋)。反應(yīng)時間視金標(biāo)抗體的稀釋度而定：一般1：25稀釋(OD520 nm值約為0.2)，反應(yīng)時間為2h;1：100-1：200稀釋(OD520 nm值約為0.005)，反應(yīng)時間為16h;

5. TBS沖洗，即可觀察結(jié)果。此過程為dot-IGS。

6. 需要是可繼續(xù)進行銀顯色反應(yīng)，行dot-IGSS：將金標(biāo)抗體染色后的NC膜，用TBS洗三次，每次5min，再用蒸餾水洗滌兩次以去除Cl- ，浸入0.2mol/L，pH3.5枸櫞酸緩沖液內(nèi)2min;

7. 移入銀顯色液中，避光顯色5-10min后，再移入定影液中，定影5min;

8. 自來水沖洗，自然干燥;

結(jié)果觀察

dot-IGS：VE Elisa Kit在NC膜上呈粉紅色;dot-IGSS：在NC膜上呈棕黑色。

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